Nach dem Studium der Deutschen Philologie und Evangelischen Theologie in Göttingen, Tübingen, Jerusalem und Strasbourg und dem 1. und 2. Kirchlichen Examen wurde Markus Matthias 1988 in Erlangen zum Dr. theol. Promoviert. Er war anschließend Wissenschaftlicher Mitarbeiter am DFG-Projekt Spener-Briefe in Bochum und wissenschaftlicher Assistent in Halle an der Saale, wo er sich 2002 für das Fach Evangelische Kirchengeschichte habilitierte.
Im Jahr 2008 wurde Matthias nach Vertretungsprofessuren in Dresden, Kiel und Heidelberg auf den Lehrstuhl Lutherana (Geschichte und Theologie Luthers und des Luthertums) an der Protestantischen Theologischen Universität (damals Utrecht-Kampen Leiden, jetzt Amsterdam-Groningen) berufen.
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